Pour être analysées, les cellules sont injectées dans une gaine à l'intérieur de laquelle elles sont entraînées dans un flux liquide jusqu'à une cellule d'analyse à la sortie de laquelle elles passent une à une devant un faisceau laser qui excite les marqueurs fluorescents. Chaque cellule marquée produit un flash de fluorescence variant avec les propriétés biologiques particulières de la cellule analysée. La lumière émise est collectée et dirigée vers des détecteurs qui transforment les signaux lumineux optiques en signaux électroniques proportionnels à la quantité de lumière collectée. Ces valeurs numériques sont envoyées vers un ordinateur et les résultats apparaissent sous la forme d'histogrammes mono ou multiparamétriques.

On peut ainsi analyser jusqu'à 30000 cellules par secondes et plus de 10 paramètres par cellule. Une autre caractéristique de la cytométrie en flux est de pouvoir trier physiquement les cellules en fonction de leurs caractéristiques observées lors de l'analyse.